一、检测原理

 

　　紫外可见分光光度法基于样品分子对特定波长紫外或可见光的吸收特性。当光通过样品溶液时，样品中的分子会吸收特定波长的光，导致透射光强度减弱。根据朗伯-比尔定律，吸光度(A)与样品浓度(c)成正比：

 

　　A=εcl

 

　　其中ε为摩尔吸光系数，l为光程长度(通常为1cm)。纯度检测主要利用这一原理，通过比较样品在特定波长下的吸光度与标准品的吸光度，或通过分析吸收光谱特征来判断样品纯度。

 

　　二、操作步骤

 

　　1.样品准备：将待测样品溶解于适当溶剂中，浓度通常控制在使吸光度在0.1-1.0范围内(此范围内仪器响应最线性)。常用溶剂包括水、甲醇、乙腈等，需确保溶剂在测定波长范围内无明显吸收。

 

　　2.仪器预热与校准：打开光度计电源，预热15-30分钟。用纯溶剂作为空白进行基线校正，确保仪器处于稳定状态。

 

　　3.光谱扫描：设置合适的波长范围(通常200-800nm)，对样品溶液进行全波长扫描，获取吸收光谱。

 

　　4.数据分析：

 

　　-观察吸收峰位置和形状是否与标准品一致

 

　　-计算特定波长下的吸光度比值，判断是否存在杂质

 

　　-通过摩尔吸光系数计算样品浓度，评估纯度

 

　　5.定量分析：在最大吸收波长处测定吸光度，利用标准曲线或已知的摩尔吸光系数计算样品浓度和纯度。

 

　　三、纯度评估方法

 

　　1.吸收峰比值法：纯化合物在紫外可见区的吸收峰位置和相对强度是特定的。通过比较样品在不同波长下的吸光度比值与标准品的差异，可判断纯度。例如，核酸纯度常通过A260/A280比值评估。

 

　　2.光谱形状分析：纯物质的光谱曲线平滑，特征峰明显。杂质的存在常导致基线抬高、峰形不对称或出现额外小峰。

 

　　3.摩尔吸光系数法：对于已知ε值的化合物，通过测定吸光度可计算浓度，进而评估纯度。需准确知道样品分子量和光程长度。

 

　　4.导数光谱法：利用高阶导数光谱增强细微光谱差异的识别，提高对微量杂质的检测灵敏度。

 

　　四、注意事项

 

　　1.溶剂选择：确保溶剂在测定波长范围内无显著吸收，且能充分溶解样品。常用溶剂截止波长：水(190nm)、乙腈(190nm)、甲醇(205nm)、氯仿(245nm)。

 

　　2.浓度控制：吸光度最好在0.1-1.0范围内，过高会导致偏离比尔定律，过低则信噪比差。可通过稀释或浓缩调整。

 

　　3.比色皿清洁：使用前后用适当溶剂清洗比色皿，避免刮伤光学面。指纹或污渍会严重影响测量结果。

 

　　4.温度控制：某些化合物的吸收特性受温度影响明显，必要时使用恒温比色皿架。

 

　　5.仪器性能验证：定期用标准物质(如重铬酸钾溶液)验证仪器波长准确性和吸光度准确性。

 

　　五、应用实例

 

　　1.蛋白质纯度检测：通过A280/A260比值评估蛋白质样品中核酸污染程度，纯蛋白比值约1.8。

 

　　2.DNA/RNA纯度检测：纯DNA的A260/A280比值约1.8，RNA约2.0，偏离此值表明可能有蛋白质或酚类污染。

 

　　3.药物纯度检测：比较样品与标准品吸收光谱的一致性，检测可能存在的杂质或降解产物。

 

　　紫外可见分光光度法作为快速、简便的纯度检测手段，虽不能替代色谱等分离分析方法，但在日常质量控制、实验过程监测中具有重要价值。结合其他分析技术，可对样品纯度做出更全面评估。